引言｜面对双特异性抗体的复杂结构如何“应对分离挑战”？
双特异性抗体（BsAbs）以其多靶点机制在肿瘤免疫治疗中展现巨大潜力。截至2024年底，已有19款BsAb药物上市，300多项临床试验在全球范围内开展。
由于双特异性抗体的巨大治疗潜力促使迄今为止已开发出超过50种不同的重组双特异性抗体结构。其可大致分为两类：不含Fc区的（Non IgG like BsAb）和含Fc区域（IgG like BsAb），含Fc区域又分为对称性(Symmetric)和非对称性双抗（Asymmetric）。
但BsAbs独特的结构复杂性，也带来了大量产品相关杂质，如同源二聚体（homodimer）、轻链缺失产物（LC-missing byproduct）、半抗（half antibody）以及聚集体等。由于这些杂质与目标分子的物理化学性质接近，常规的离子交换层析往往难以实现有效分离。
为此，复合模式层析（Mixed-Mode Chromatography）作为一种集多种作用力于一体的新型分离纯化介质，正在双抗纯化中发挥关键作用。
什么是复合模式层析？
博格隆研发的Diamond MMC Mustang为代表的复合模式介质，具有以下多重机制：
•弱阳离子交换作用
•氢键作用
•疏水作用
可广泛适用于聚集体、片段、轻链缺失产物、半抗、同源二聚体等复杂杂质的去除。
工艺实证案例
去除聚集体与片段
•分子：Bispecific antibody
•样品：Protein A eluate (pH adjusted to 5.5)
•Buffer：50 mM NaAc-HAc, pH 5.5；50 mM NaAc-HAc, 1 M NaCl, pH 5.5
•上样载量：35 g/L 与 80 g/L
•梯度：0-100% B 20CV线性盐浓度递增
结果：Diamond MMC Mustang在不同载量下分辨率稳定，媲美进口对标产品
Fig.1 Diamond MMC Mustang与某进口介质分离纯化层析图谱
Fig.2 Diamond MMC Mustang与某进口介质分离后样品的SDS-PAGE结果
去除轻链缺失产物
•分子：Symmetric WuXiBody
•分离原理：pI差异（双抗与LC-missing byproduct相差0.21）→结合力不同 → 成功分离
•样品：Protein A eluate (pH adjusted to 6.0)
•Buffer：40 mM phosphate buffer, pH 6.0；40 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl, pH 6.0
•梯度：0-100% B 20CV线性盐浓度递增
结果：实现双抗与LC-missing byproduct的分离，由SDS-PAGE图可峰尾为LC-missing byproduct。
Fig.3 复合阳离子介质分离LC-missing byproduct层析图谱以及质控
线性pH梯度去除半抗与homodimer
•分子：Bispecific antibody(Asymmetric IgG-like knobs-into-holes)
•分离原理：半抗、hole-hole homodimer、bsAb、聚集体在复合性阳离子上的结合力差异
•样品：Protein A eluate (pH was adjusted to 7.0 and (NH4)2SO4 was added to 1 M)
•Buffer：20mM Na-citrate, 20mM NaH2PO4, 20mMTris, 20mM glycine, pH 5.5；20mM Na-citrate, 20mM NaH2PO4, 20mM Tris, 20mM glycine, pH10.0
•梯度：0-100% B 20CV线性pH递增
结果：由层析图谱和SDS-PAGE图可知成功分离半抗、homodimer与聚集体
Fig.4 复合阳离子介质分离半抗、homodimer层析图谱以及质控
利用疏水作用去除片段与聚集体
•分子：Bispecific antibody
•分离原理：高盐结合，低盐洗脱 → 去除片段与聚集体
•样品：Protein A eluate (pH was adjusted to 7.0 and (NH4)2SO4 was added to 1 M)
•Buffer：50 mM Tris-HAc, 1 M (NH4)2SO4, pH 7.0；50 mM Tris-HAc, pH 7.0
•上样载量：30 g/L
•梯度：0-100% B 20CV 盐浓度递减（1M (NH₄)₂SO₄ → 0）
结果：成功分离片段与聚集体，与进口对标产品表现一致
Fig.5 复合阳离子介质分离片段、聚集体层析图谱以及质控
Diamond MMC Mustang批次间一致性评估
为了评估填料的批次间的一致性，本实验使用三个不同批次的Diamond MMC Mustang介质分别装填的色谱柱，在相同条件下进行了三次纯化。
•由叠加层析图谱，可知三批次洗脱图谱重现性高，分离效果优异，,三个批次性能高度一致，如下图所示
•三批次5%DBC也表现出一致性（批次1、2和3的5%DBC分别为94、94和95 mg/ml）
•三批次洗脱液质量、收率表现一致
Fig.6 Diamond MMC Mustang介质三个批次的层析图谱
小结
复合模式层析作为双抗下游纯化的重要补充手段，凭借其多种作用机制，能有效解决常规层析难以分离的杂质问题。它不仅为产品质量提升提供保障，也为工艺流程简化提供了新思路。
想了解更多复合层析工艺优化？欢迎联系我们获取资料与技术支持！
参考文献
[1] Klein, Christian, et al. "The present and future of bispecific antibodies for cancer therapy." Nature reviews Drug discovery 23.4 (2024): 301-319.
[2] Li, Yifeng , et al. "A roadmap for IgG-like bispecific antibody purification." Approaches to the Purification, Analysis and Characterization of Antibody-Based Therapeutics (2020).
[3] Li, Yifeng . "A brief introduction of IgG-like bispecific antibody purification: Methods for removing product-related impurities." Protein Expression and Purification 155(2019):112-119.
[4] Chen, Serene W , and W. Zhang . "Current trends and challenges in the downstream purification of bispecific antibodies." Antibody Therapeutics 4.2(2021).
[5] Zhang, Shengwei , et al. "Evaluating a new mixed-mode resin Diamond MMC Mustang using Capto MMC ImpRes as a benchmark." Protein Expression and Purification 186(2021):105930.
[6] Tang, Jiaqin. , et al. "Removal of half antibody, hole-hole homodimer and aggregates during bispecific antibody purification using MMC ImpRes mixed-mode chromatography." Protein expression and purification 167(2020):105529.